PCRで増幅されないときの対処法｜原因を最短で切り分けるチェックリスト

2026/07/29

最短で原因を切り分けるチェックリスト

PCRで全くバンドが得られない場合、原因はDNA、プライマー、PCR条件、試薬、電気泳動のいずれかにあります。やみくもに条件を変更するのではなく、原因を一つずつ切り分けていくことが重要です。本記事では、確認すべき順番に沿って対処法を整理します。

① ポジティブコントロール・ネガティブコントロールを確認する

最初に確認すべきなのは、PCR反応自体が正常に機能しているかどうかです。

この確認を行うことで、「鋳型DNAの問題なのか」「PCR反応全体の問題なのか」を切り分けることができます。

ポジティブコントロールは増幅するが目的サンプルだけ増幅しない場合は、プライマーの結合効率が十分でない可能性があります。

まずはアニーリング温度を5℃以上下げてPCRを行ってみることをおすすめします。この段階では非特異的バンドが出ても問題ありません。まず目的サイズ付近にバンドが現れることを確認し、その後に温度を少しずつ上げて最適条件を探索します。

実際には、PCRが失敗する原因として最も多いのは鋳型DNAに含まれるPCR阻害物質です。そのため、DNAを再抽出する前に、まず希釈を試してみることをおすすめします。

など複数の濃度でPCRを試してみてください。DNA濃度は低下しますが、それ以上にPCR阻害物質も希釈されるため、増幅が改善することがあります。

サンプルに余裕がある場合は、DNAの再抽出が最も確実な改善方法です。植物や土壌などではPCR阻害物質が多く含まれるため、一度の抽出で十分な品質が得られないことがあります。

再採取できない貴重なサンプルでは、既存のDNAを精製し直す方法があります。市販のDNAクリーンアップカラムを使用して精製し、溶出液は2回に分けて回収すると、DNA回収率を維持しながら不純物を低減できる場合があります。

プライマー濃度が低すぎると十分な増幅が得られません。逆に高すぎてもプライマーダイマーや非特異的増幅の原因となるため、推奨範囲内で濃度を変更して検討します。

意外と見落とされるのが、PCRではなく電気泳動側の問題です。例えば、次のような点に問題があると、PCR産物が存在していても確認できないことがあります。

PCRが増幅されない場合は、次の順番で確認すると効率よく原因を切り分けられます。

バイオインサイトでは、環境DNA分析・食品DNA分析・DNA種判別など、PCRを用いた各種受託分析サービスを提供しています。実験の立ち上げやトラブルシューティングでお困りの際は、お気軽にお問い合わせください。